GMP實(shí)驗(yàn)室工程理化分析方法驗(yàn)證和確認(rèn)

（1）適用范圍

以下內(nèi)容適用于化學(xué)制品、生物制品（包括物料和產(chǎn)品）的理化分析方法。

（2）哪些分析方法需要驗(yàn)證和確認(rèn)?

原則上各類方法均需進(jìn)行驗(yàn)證，依照方法來(lái)源和適用范圍的不同，驗(yàn)證的要求有所不同。標(biāo)準(zhǔn)方法通常認(rèn)為在被確定為標(biāo)準(zhǔn)方法前已經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，使用者在首次采用此類方法前只需進(jìn)行確認(rèn)來(lái)證明實(shí)際使用條件下方法的適用性。

需要進(jìn)行驗(yàn)證或確認(rèn)的分析方法包括:鑒別，雜質(zhì)定量以及限度測(cè)試，物料和產(chǎn)品有效成分含量測(cè)定，制劑中其他成分（如防腐劑等，添加劑等）的定量測(cè)試，溶出度，釋放度的溶出量測(cè)試。此外一些物理參數(shù)的測(cè)試（例如粒徑分布、旋光度等)方法也需要進(jìn)行適當(dāng)程度的驗(yàn)證。

（3）方法驗(yàn)證性能參數(shù)的選擇

方法驗(yàn)證參數(shù)的選擇應(yīng)基于方法類型和實(shí)際應(yīng)用環(huán)境，并非總要對(duì)所有的分析性能參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

（4）方法確認(rèn)性能參數(shù)的選擇

分析方法確認(rèn)是指已經(jīng)驗(yàn)證過(guò)的方法在實(shí)際使用條件下的適用性的確認(rèn)試驗(yàn)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室基本的、已成為日常操作的法定測(cè)試方法不需要進(jìn)行確認(rèn)，除非有現(xiàn)象表明法定測(cè)試方法不適用于被測(cè)的物質(zhì)。

不同的監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)于方法確認(rèn)的技術(shù)要求略有差別,使用者應(yīng)針對(duì)不同監(jiān)管機(jī)構(gòu)的技術(shù)要求，通過(guò)對(duì)分析方法類別、產(chǎn)品屬性以及方法使用過(guò)程中可能出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)的定義和識(shí)別來(lái)選擇方法確認(rèn)活動(dòng)的具體驗(yàn)證參數(shù)，不限制對(duì)參數(shù)的適當(dāng)?shù)募訃?yán)或放寬。

（5）性能參數(shù)的驗(yàn)證

方法驗(yàn)證試驗(yàn)中各個(gè)參數(shù)的測(cè)試順序沒(méi)有官方的指南，優(yōu)選順序取決于方法本身。建議耗時(shí)很長(zhǎng)或者需要替換試驗(yàn)條件的參數(shù)測(cè)試一般放在后面執(zhí)行，如方法耐用性。適用時(shí)某些參數(shù)可以合并在一起試驗(yàn)，如精密度和準(zhǔn)確度測(cè)試。

①專屬性    專屬性定義為“當(dāng)預(yù)料到一些組分可能存在時(shí)，準(zhǔn)確無(wú)誤地檢測(cè)被分析物的能力。通常這些可能存在的組分有雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、基質(zhì)等”。專屬性的研究一般優(yōu)先于其他驗(yàn)證項(xiàng)目，為方法首要的屬性,鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查、含量測(cè)定方法應(yīng)考察其專屬性。一種方法不夠?qū)伲捎善渌治龇椒ㄓ枰匝a(bǔ)充。

a.鑒別    鑒別試驗(yàn)應(yīng)證明被分析物符合其特征，專屬性試驗(yàn)要求證明能與可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似化合物區(qū)分，通常通過(guò)含被分析物的樣品呈正反應(yīng)，而不含被分析物的樣品呈負(fù)反應(yīng)，結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物也應(yīng)呈負(fù)反應(yīng)的途徑來(lái)證明。

b.雜質(zhì)檢查    在可獲得雜質(zhì)情況下，可向供試品中加入一定量的雜質(zhì)，證明雜質(zhì)與共存物質(zhì)能得到分離和檢出。在不能獲得雜質(zhì)或降解產(chǎn)物情況下，專屬性可通過(guò)與另一種已證明合理但分離或檢測(cè)原理不同，或具較強(qiáng)分辨能力的方法進(jìn)行結(jié)果比較來(lái)確定。或?qū)⒐┰嚻酚脧?qiáng)光照射、高溫、高濕、酸（堿）水解及氧化的方法進(jìn)行破壞，比較破壞前后檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)和量。必要時(shí)可采用二極管陣列檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)。

c.含量測(cè)定    在可獲得雜質(zhì)情況下，對(duì)于主成分含量測(cè)定可在供試品中加入雜質(zhì)或輔料，考察測(cè)定結(jié)果是否受干擾，并與未加雜質(zhì)和輔料的試樣比較測(cè)定結(jié)果。

在不能獲得雜質(zhì)情況下，可采用另一個(gè)經(jīng)驗(yàn)證方法進(jìn)行比較，對(duì)比兩種方法測(cè)定的結(jié)果。也可采用破壞性試驗(yàn)[強(qiáng)光照射、高溫、高濕、酸（堿)水解及氧化]，得到含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣，用兩種方法進(jìn)行含量測(cè)定比較測(cè)定結(jié)果。必要時(shí)進(jìn)行色譜峰純度檢查，證明含量測(cè)定成分的譜峰中不包含其他成分。

②精密度    精密度系指在規(guī)定的條件下，同一份均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

精密度可以在以下三個(gè)層面考慮:重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性。在相同條件下，由同一個(gè)分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度稱為重復(fù)性;在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備測(cè)定所得結(jié)果之間的精密度，稱為中間精密度;在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測(cè)定所得結(jié)果之間的精密度，稱為重現(xiàn)性。

a.重復(fù)性    在進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證時(shí)，要求待測(cè)組分濃度在100%時(shí)重復(fù)測(cè)量至少6次或覆蓋整個(gè)規(guī)定濃度范圍并重復(fù)測(cè)量至少9次。例如，可以在三個(gè)不同濃度分別進(jìn)樣三次。

b.中間精密度    中間精密度通過(guò)比較同一實(shí)驗(yàn)室數(shù)日內(nèi)各次檢測(cè)的結(jié)果計(jì)算而得。方法的中間精密度可以反映以下因素引起的結(jié)果差異:不同的操作人員;不一致的操作時(shí)間;不同的儀器;不同供應(yīng)商的標(biāo)準(zhǔn)品和試劑;不同批次的色譜柱;綜合因素。

中間精密度驗(yàn)證的目的是證實(shí)方法在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)運(yùn)行能夠得到相同的結(jié)果。

c.重現(xiàn)性    重現(xiàn)性的目的是證實(shí)分析方法在不同實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行能夠得到相同的結(jié)果。分析方法的重現(xiàn)性是通過(guò)不同實(shí)驗(yàn)室的不同分析人員對(duì)均勻樣品分析的結(jié)果計(jì)算而得的。重現(xiàn)性的驗(yàn)證對(duì)于在不同實(shí)驗(yàn)室使用的方法來(lái)說(shuō)非常重要。

d.精密度數(shù)據(jù)要求    精密度驗(yàn)證均應(yīng)報(bào)告偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間。在基質(zhì)復(fù)雜、含量低干0.01%及多成分等分析中，精密度接受范圍可適當(dāng)放寬。

③準(zhǔn)確度    準(zhǔn)確度足義為測(cè)定值與真實(shí)值或認(rèn)可的參考值之間接近的程度。準(zhǔn)確度也可以定義為方法的測(cè)定值與真實(shí)值接近的程度。

準(zhǔn)確度為定量測(cè)定的必要條件，因此涉及定量測(cè)定的檢測(cè)項(xiàng)目均需要驗(yàn)證準(zhǔn)確度，如含量測(cè)定、雜質(zhì)定量試驗(yàn)等。準(zhǔn)確度試驗(yàn)濃度應(yīng)能覆蓋整個(gè)考慮范圍，并且應(yīng)包含接近定量限的濃度點(diǎn)，濃度范圍的中間值,還有校正曲線的最高點(diǎn)。

a.含量測(cè)定

制劑可用含已知量被測(cè)物的各組分混合物進(jìn)行測(cè)定。如不能得到制劑的全部組分，可向制劑中加入已知量的被測(cè)物講行測(cè)定，必要時(shí)，與另一個(gè)已建立準(zhǔn)確度的方法比較結(jié)果。中凈環(huán)球凈化可提供無(wú)塵車(chē)間、潔凈車(chē)間、凈化車(chē)間的咨詢、規(guī)劃、設(shè)計(jì)、施工、安裝改造等配套服務(wù)。

b.雜質(zhì)定量試驗(yàn)    雜質(zhì)的定量試驗(yàn)可向制劑中加入已知量雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。如果不能得到雜質(zhì)，可用本法測(cè)定結(jié)果與另一成孰的方法進(jìn)行比較，如經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法。

如不能測(cè)得雜質(zhì)的相對(duì)響應(yīng)因子，可在線測(cè)定雜質(zhì)的相關(guān)數(shù)據(jù)，如采用二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定紫外光譜，當(dāng)雜質(zhì)的光譜與主成分的光譜相似，則可采用原料制品的響應(yīng)因子近似計(jì)算雜質(zhì)含量（自身對(duì)照法）。并應(yīng)明確單個(gè)雜質(zhì)和雜質(zhì)總量相當(dāng)于主成分的質(zhì)量比(%)或是面積比(%)。

c.化學(xué)成分測(cè)定方法的準(zhǔn)確度    可用對(duì)照品進(jìn)行加樣回收率測(cè)定,即向已知被測(cè)成分含量的供試品中再精密加入一定量的被測(cè)成分對(duì)照品，依法測(cè)定。用實(shí)測(cè)值與供試品中含有量之差，除以加入對(duì)照品計(jì)算回收率。在加樣回收試驗(yàn)中需注意對(duì)照品的加入量與供試品中被測(cè)成分含有量之和須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)。

d.校正因子的準(zhǔn)確度    本文中的校正因子是指氣相色譜法和高效液相色譜法中的相對(duì)重量校正因子。絕對(duì)（或定量）校正因子是指單位面積的色譜峰代表的待測(cè)物質(zhì)的量,待測(cè)定物質(zhì)與所選定的參照物質(zhì)的絕對(duì)校正因子之比,即為相對(duì)校正因子。

相對(duì)校正因子可采用替代物（對(duì)照品）和被替代物（待測(cè)物）標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值進(jìn)行比較獲得;采用紫外吸收檢測(cè)器時(shí)，可將替代物（對(duì)照品）和被替代物（待測(cè)物）在規(guī)定波長(zhǎng)和溶劑條件下的吸收系數(shù)比值進(jìn)行比較，計(jì)算獲得。

e.準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)要求    在規(guī)定范圍內(nèi),取同一濃度（相當(dāng)于100%濃度水平）的供試品，至少測(cè)定6份樣品的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià);或設(shè)計(jì)3種不同濃度，每種濃度分別制備3份供試品溶液，用9份樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。化學(xué)制品應(yīng)報(bào)告已知加入量的回收率（%)，或測(cè)定結(jié)果平均值與真實(shí)值之差及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間（置信度一般為95%)；制品應(yīng)報(bào)告供試品取樣量、供試品中含有量、對(duì)照品加入量、測(cè)定結(jié)果和回收率（%）計(jì)算值，以及回收率（%）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD)或置信區(qū)間。校正因子應(yīng)報(bào)告測(cè)定方法、測(cè)定結(jié)果和RSD。

④線性    線性系指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)定響應(yīng)值與試樣中被測(cè)物濃度呈比例關(guān)系的程度。

線性可以直接用待測(cè)物質(zhì)測(cè)定（通過(guò)稀釋標(biāo)準(zhǔn)貯備液）或分別稱取待測(cè)品種的各組分后合成混合物。配制5個(gè)以上不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度范圍至少在期望濃度的80%～120%之間)，用試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算線性。響應(yīng)值應(yīng)與被分析物的濃度成直接的比例關(guān)系，或通過(guò)定義明確的數(shù)學(xué)計(jì)算形成比例關(guān)系。用于結(jié)果計(jì)算的線性回歸方程其截距不得明顯偏離零點(diǎn)。如果得到一個(gè)顯著的非零截距,應(yīng)證明其對(duì)方法準(zhǔn)確度無(wú)影響。

應(yīng)報(bào)告線性曲線的相關(guān)系數(shù)、y軸截距、回歸線斜率和殘差平方和。報(bào)告中還應(yīng)包括數(shù)據(jù)圖。

⑤范圍     范圍系指分析方法能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性要求時(shí)的高低限濃度或量的區(qū)間。分析方法的范圍一般用與檢測(cè)結(jié)果相同的單位表述（例如，百分比)。對(duì)于含量測(cè)定，要求的小范圍是檢測(cè)濃度的80%～120%。雜質(zhì)的范圍擴(kuò)展為定量限到每種雜質(zhì)規(guī)定限度的120%,或雜質(zhì)規(guī)定限度的50%～120%。

⑥檢測(cè)限和定量限  

檢測(cè)限常常與方法的靈敏度相混淆，靈敏度是以響應(yīng)值對(duì)被分析物的濃度或質(zhì)量作圖所得校正曲線的斜率。

定量限和檢測(cè)限測(cè)定方式列舉如下。

a.視覺(jué)判斷    通過(guò)測(cè)定待測(cè)成分濃度已知的樣品，并確定該成分能被可靠檢出的低水平來(lái)計(jì)算檢測(cè)限。

b.信噪比法    通過(guò)比較測(cè)得的已知低濃度的樣品信號(hào)和空白樣品的信號(hào)，建立能夠監(jiān)測(cè)的被測(cè)物的低濃度所得到的方法。

c.基于空白的響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差    通過(guò)分析適當(dāng)數(shù)量的空白樣品并計(jì)算所得響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)測(cè)量分析背景響應(yīng)值的大小。

檢測(cè)限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)附測(cè)定圖譜，說(shuō)明試驗(yàn)過(guò)程和檢測(cè)限結(jié)果;定量限數(shù)據(jù)還應(yīng)包括準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證數(shù)據(jù)。

⑦耐用性    耐用性系指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí),測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，為所建立的方法用于日常檢驗(yàn)提供依據(jù)。

確定方法的耐用性時(shí)，使一系列的方法參數(shù)在一定的范圍內(nèi)變動(dòng)，測(cè)定這些變動(dòng)對(duì)結(jié)果的量化影響。如果參數(shù)的影響在預(yù)先設(shè)定的允許范圍內(nèi),則證實(shí)方法在該參數(shù)范圍內(nèi)耐用。

耐用性試驗(yàn)可以確定分析方法的關(guān)鍵參數(shù)及其允許的容量范圍，并可以幫助評(píng)估一種或某種參數(shù)變化后方法是否需要重新驗(yàn)證。在方法開(kāi)發(fā)階段應(yīng)考慮通過(guò)評(píng)估的方式確定耐用性試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)，這也是“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”（QbD)在方法開(kāi)發(fā)中的體現(xiàn)。

⑧穩(wěn)定性    穩(wěn)定性試驗(yàn)對(duì)于計(jì)算從樣品采集到樣品分析之間的允許時(shí)間非常重要，避免在制備樣品溶液、提取、凈化、相轉(zhuǎn)移或樣品瓶的貯存（在冰箱或在自動(dòng)進(jìn)樣器里）過(guò)程中化學(xué)化合物在分析前發(fā)生降解。

用于穩(wěn)定性試驗(yàn)的條件應(yīng)反映實(shí)際樣品在處理、貯存和分析時(shí)遇到的各種情況。通過(guò)比較放置周期內(nèi)的溶液與新鮮制備溶液的儀器響應(yīng)值來(lái)檢測(cè)穩(wěn)定性，通過(guò)樣品溶液的重復(fù)測(cè)試,計(jì)算測(cè)得值的RSD來(lái)確定溶液穩(wěn)定性。

（6）分析方法日常質(zhì)量控制計(jì)劃的制定

分析方法驗(yàn)證的目的不僅是在開(kāi)始使用方法時(shí)保證分析數(shù)據(jù)的有效性，還要在方法的整個(gè)使用周期內(nèi)都確保其有效性。為了證實(shí)方法和系統(tǒng)的性能在樣品分析時(shí)與開(kāi)始規(guī)定的相同,應(yīng)在常規(guī)的樣品分析中納入適當(dāng)?shù)臋z查手段。

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